In vitro and in vivo characterization of dmHexDC function
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Boğaziçi Üniversitesi, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2018
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: EMİR ERKOL
Danışman: ARZU ÇELİK FUSS
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Moleküllerin glikozilasyonu, hücre-hücre iletişiminden hücre farklılaşmasına kadar uzanan çok çeşitli hücresel faaliyetler için önemlidir ve birçok nörogelişimsel bozuklukta değişmiş olduğu gözlemlenir. β-Hekzosaminidazlar glikanların indirgeyici olmayan ucunda bulunan N-asetil-β-D-hekzosamin kalıntıların katalizini hidrolize ederek glikokonjugatları işlemektedir. Önceki çalışmalarda, Drosophila melanogaster'de N-asetil-β-D-glukozamin kalıntılarını kesen üç hekzosaminidaz karakterize edilmiştir. Grubumuz genetik taramalarla Drosophila'nın göz imge diskinde R7 fotoreseptörlerinde ve pre-nöronal hücrelerde ifade edilen yeni bir hekzosaminidaz olan dmHexDC'yi tespit etmiştir. dmHexDC'nin nörogelişimdeki rolü hakkında fonksiyonel bir bakış açısı elde etmek için, dmHexDC'nin biyokimyasal fonksiyonunu tanımladım ve her iki terminal N-asetil-β-D-glukozamin ve N-asetil-β-D-galaktozamin kalıntılarını in vitro olarak hidrolize ettiğini gösterdim. Her ne kadar dmHexDC her iki substratı hidrolize edebilse de, substrat özgüllüğü N-asetil- β -D-galaktozamin kalıntılarına daha yatkındır. Ayrıca, dmHexDC'nin bir homoloji modeli üretildi ve bu model GH20 ailesi arasında ortak bir yapı olan bir (β / α)8 -fıçı topolojisine benzediği gösterildi. dmHexDC'nin katalitik aktivitesine katılan anahtar kalıntılar homoloji modelinden araştırılmış ve 347. pozisyondaki glutamik asit, genel asit / baz kalıntısı olarak tanımlanmıştır. Ayrıca, E347A mutantları N-asetil- β -D-hekzosamin substratlarında azalan katalitik aktivite sergilemiştir. Bu, E347A mutasyonunun in vivo entegrasyonunun, dmHexDC için bir hipomorf oluşturacağı ileri sürdü. In vivo fonksiyonel çalışmalarına hızlı ve verimli dmHexDC mutantları üretmek için, dmHexDC'nin çıkarılması ve CRISPR / Cas9 gen düzenleme yöntemi kullanarak ters attP dizileri ile çevrili white genin entegre edilmesi yoluyla rekombinaz aracılı kaset değişimi (RMCE) şablon mutantı ürettim. İlgilenilen herhangi bir DNA, mutantın dmHexDC gen bölgesine yüksek verimlilikle kaset değişimi ile entegre edilebilir. Mutant alel için homozigot olan sineklerin canlı olduğu gözlendi ve dmHexDC içermeyen homozigot mutantların, göz imge disklerinin ventral tarafında hafif nöronal kayıplara sahip olduğunu gösterdim.