Purification of Pst I endonuclease from providencia stuartii 164
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Boğaziçi Üniversitesi, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2001
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: ERDEM FEHMİ ÇELİK
Danışman: ŞEFİKA KUTLU ÜLGEN
Özet:ÖZET PST I ENDONUKLEAZININ PROVIDENCIA STUARTII 164'DEN SAFLAŞTIRILMASI Pst I endonükleazı, Providencia stuartii 164'ün restriksiyon enzimi olup genellikle rekombinant DNA teknolojisinde kullanılır. DNA üzerindeki spesifik dizileri tanıyarak çift sıralı kesimler meydana getirme özelliğine sahiptir. Pst I restriksiyon enzimi üzerindeki çalışmalar, dializ, sonikasyon, amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değişimi kromatografısi ve hidroksiapatit kromatografısi aşamalarından oluşan klasik yöntemlerin kullanılarak saflaştırılmasından ibarettir. Bu beş aşamalı klasik prosedür ile elde edilen Pst Fin aktivitesi birim yaş hücrede 990 ünite, spesifik aktivitesi ise miligram proteinde 64 100 ünite olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada ise Pst I endonükleazı için yüksek performanslı iyon değişimi kromatografık yöntemi kuallanılarak kısa bir saflaştırma prosedürü geliştirilmeye çalışılmıştır. Waters Katyon Değiştirici Protein Pak SP 8HR-Apl ve Anyon Değiştirici Protein Pak DEAE 15HR-AP1 kolonları kullanılarak, kromatografik ortamın Pst Fin ayrıştırılması ve geri kazanılması üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yüksek performanslı iyon değişimi kromatografık yöntemi kolonlarına uygun olan ve aktif Pst I endonükleaz fraksiyonlarının geri kazanılmasında kullanılan çeşitli mobil faz sistemleri test ve optimize edilmiştir. Bunlardan L-Histidine mobil fazı, fraksiyonlarda aktif Pst I endonüzkleazıyla sonuç vermiştir. Geri kazanılan enzimin aktifliği ve saflığı ise sırasıyla agaroz jel elektroforez ve SDS-poliakrilamid jel elektroforez yöntemleri ile kontrol edilmişlerdir. SDS-poliakrilamid jel elektroforez yöntemi, yüksek performanslı iyon değişimi kromatografık yöntemi deneylerinin 74 ve 78inci dakikalarında Pst I'm ve diğer proteinlerin varlığını göstermektedir.