Optimisation of stationary and mobile phases for the purification of Pst I endonuclease by ion exchange chromatography
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Boğaziçi Üniversitesi, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2004
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: CÜNEYT MEHMET KATIEL
Danışman: ŞEFİKA KUTLU ÜLGEN
Özet:ÖZET Pst I ENDONUKLEAZININ İYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFISI YÖNTEMİYLE SAFLAŞTIRILMASINDA DURGUN VE HAREKETLİ FAZLARIN UYGUNLUĞUNUN İNCELENMESİ Bakteriyel endonükleazlann özel bir sınıfı olan restriksiyon endonükleazları, çift zincir DNA üzerindeki spesifik nükleotid dizilerini tanıyabilir ve çift sıralı kesimler üretebilir. Providencia stuartii 164'ün ürettiği Pst I endonükleazı, DNA üzerinde simetrik 5'-C-T-G-C-A-G-3' and 3'-G-A-C-G-T-C-5' nükleotid dizinini kesen bir restriksiyon enzimidir. Bugüne kadar Pst I endonükleazının saflaştırılması diyaliz, çökeltme ve iyon değişimi kromatografisi gibi çeşitli yöntemlerle başarılmıştır. Bu çalışmada ise Waters Cation Exchange Protein Pak; SP 8HR-AP1 ve Anion Exchange Protein Pak; DEAE 15HR-AP1 iyon değişimi kolonları kullanılarak bu kolon tiplerinin Pst I endonükleazının geri kazanılması ve ayrılması üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Pst I endonükleazının saflaştırılması, yüksek performanslı iyon değişimi kromatografı yöntemiyle Sodyum Asetat (pH: 5.0), Potasyum Fosfat (pH: 7.0), Tris (pH: 8.0) ve L-Histidine (pH: 6.0) hareketli fazlan kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Katyon değişimi kolonu kullanılarak yapılan deneyler daha iyi sonuçlanmış, fakat aktif enzim kazanımı bakımından ise anyon değişimi kolonuyla yapılan deneylerden çok daha iyi verimler elde edilmiştir. Aktif enzimin geri kazanılması açısından L-Histidine (pH: 6.0) hareketli fazı, bu tezde kullanılan diğer hareketli fazlarla kıyaslanıldığında en uygun hareketli faz olarak bulunmuştur. Yüksek performanslı iyon değişimi kromatografisi ile deneyler gerçekleştirildikten sonra geri kazanılmış enzim fraksiyonlarının aktivitesi ve saflığı sırasıyla agaroz jel elektoforezi ve SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yöntemleriyle kontrol edilmiştir ve beşer dakikalık aralarla deney boyunca toplanmış olan nümunelerdeki protein konsantrasyonu ise Bradford testiyle tespit edilmiştir. Kalite kontrol testi ile de yapışmayı engelleyebilecek ya da DNA son ucunu küçültecek olan safsızlık yapıcı maddelerin varlığı kontrol edilmiştir.