Application of high performance liquid chromatography to the purification of restriction enzymes
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Boğaziçi Üniversitesi, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 1997
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: SEMRA YILMAZ
Danışman: ŞEFİKA KUTLU ÜLGEN
Özet:ÖZET Restriksiyon enzimlerinin saflaştırılmasına ilişkin teknolojilerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi konularına, gen mühendisliği alanına ışık tutmak açısından, büyük önem verilmektedir. TaqI restriksiyon enzimi, sıcaklık değişimlerine dayanıklı Thermus Aquaticus hücrelerinden elde edilmekte ve daha çok moleküler alanda kullanılmaktadır. Bu çalışmada, önce BSA saflaştırılması düşük ve yüksek basınçlı kromatografi kolonlarında incelenmiş, daha sonra TaqI saflaştırılması işlemi, yüksek basınçlı likit kromatografilerde, tekli ve ikili kolon sistemlerinde gerçekleştirilmiştir, iyon değiştirici kromatografi olarak, Waters 650 E geliştirilmiş protein saflaştırma sistemi kullanılmış ve ayırma işlemi 280 nm dalga boyunda, Waters 484 Tunable Wavelength detektörüyle takip edilmiştir. Restriksiyon enzimi TaqI, gradyen kazanım metodu ile, 0.1-1 M NaCl içeren tampon (pH 7.4) çözeltinin kolondan geçirildiği bir ortamda geri kazanılmıştır. Aktivite agaroz jel elektroforezi ile, saflık ise SDS-PAGE metoduyla ölçülmüştür. Düşük basınçlı kolonlarda gerçekleştirilen ön çalışmada, kolon performansı; çalışma koşullan (uzunluk, çap, sıcaklık, besleme çözeltisi konsantrasyonu, pH gibi parametreler cinsinden), BSA proteininin DE52 iyon değiştirici üzerinde adsorplanması ortamında incelenmiştir. TaqI endonükleaz enziminin HPLC uygulanmasında ise, kolon çeşitlerinin etkileri, gradyen ve izokratik kazanımlar, hücrelerin büyüme ortamı, kolona besleme miktarı gibi parametrelerin TaqI saflaştırılmasına etkileri incelenmiştir. Test edilen kolonlar arasında, semi-preparatif DEAE anyon kolonu adsorpsiyon ve desorpsiyon kademelerinde iyi bir performans göstermiştir. Gradyen geri kazanımın, gereksiz seyreltme ve uzun ayırma işlemini en aza indirgediği için, izokratik yönteme kıyasla tercih edilebileceği görülmüştür. TYE-Castenholz içinde büyüyen hücrelerden elde edilen TaqI spesifik aktivitesinin, 1.65 kez TYE-NaCl ortamında elde edilenden daha fazla olduğu saptanmıştır. DEAE anyon kolon yükleme kapasitesi, 30 + 2 mg olarak saptanmıştır. 2 gram Thermus Aquaticus hücresinden, iki anyon kolonlu saflaştırma sisteminde, yüzde 42 oranında aktif enzim kazanımı sağlanmıştır.