Expression of recombinant CFTR protein by using two different expression systems
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Boğaziçi Üniversitesi, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2002
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: NESLİHAN GÜNEL
Danışman: ŞEFİKA KUTLU ÜLGEN
Özet:ÖZET IKI FARKLI EKSPRESYON SİSTEMİ KULLANARAK REKOMBİNANT CFTR PROTEİNİNİN EKSPRESYONU Kistik fibroz transmembran iletim düzenleyici (CFTR) proteininin üretimi, CFTR proteininin direk olarak uygulanması için gereklidir. Bu terapi yönteminin kistik fibroz hastalarında, mutasyona uğramış CFTR geni taşıyan hücrelerde klor iyonu akışını düzenlediği saptanmıştır. Bu çalışmada, CFTR proteininin ekspres edilmesi amacıyla, pUCl 8 ve pET28a+ plasmid vektörleri, CFTR geninin klonlanması ve daha sonra bu genin kodladığı proteinin E.coli hücrelerinde üretilmesi için kullanılmıştır. Çalışmanın ilk bölümünde Dr. J. Rommens tarafından gönderilen rekombinant pBQ6.2 plasmid vektöründen isole edilen CFTR geni, pUC18 plasmid vektörüne klonlandı. CFTR geninin doğru yönde klonlandığı iki rekombinant plasmid vektör elde edildi ve bu rekombinantlar sırasıyla NGCF1809 ve NGCF1810 olarak adlandırıldı. Bu recombinant plasmidler, CFTR proteini üretimi için, E.coli TBI hücrelerine transfer edildi. SDS-PAGE analizi sonucunda, moleküler ağırlığı 170 kDa olan CFTR proteinine karşılık gelen bir bant görülemedi ve bu durumun klonlanan genin sızan ekspresyonundan kaynaklanabileceği sonucuna varıldı. Çalışmanın ikinci bölümünde, CFTR geni, pET28+a plasmid vektörüne klonlandı. Düzgün bir şekilde klonlanmış genin olduğu recombinant plasmid, NGCF2877 olarak adlandırıldı ve daha yüksek seviyede CFTR proteini ekspresyonu için, lacUV5 promotörünün kontrolü altında, kromozomunda T7 RNA Polimeraz geninin bir kopyasına sahip E.coli BL21(DE3) hücrelerine transfer edildi. SDS- PAGE analizinden sonra CFTR proteinine ait bant elde edildi ve bu rekombinant plasmidin, (NGCF2877), E.coli BL21(DE3) hücrelerinde CFTR proteinini ekspres ettiği gözlendi.